L'interno di Santa Maria del Fiore, secondo il progetto di Arnolfo (1296-1302) completato da Francesco Talenti (1349-'69), è davvero grandioso. La navata centrale si presenta con alte volte gotiche che poggiano però su arcate ampie che dividono lo spazio in quattro sole campate quadrate, dando alla struttura un ritmo più classico che gotico. Le arcate poggiano a loro volta su possenti pilastri compositi dello stesso tipo ideato per la Loggia dei Lanzi.
È probabile che quello che vediamo sia il risultato di un intervento del Talenti sul progetto arnolfiano, che prevedeva certo un maggior numero di campate e di pilastri (e quindi di finestre). Lo si può intuire anche dall'affresco del Museo del Bigallo con la vecchia Santa Reparata.

L'andamento della struttura è lento e maestoso e porta con decisione verso il fulcro spaziale della basilica, costituito dal coro e dalla cupola soprastante: anche questa ricerca di un "centro di gravità" non appartiene al linguaggio gotico, che ha piuttosto una spazialità verticale e senza bisogno di gerarchie. Segno evidente del permanere a Firenze in ogni epoca del gusto classico, sostenitore di un "ordine" fra le cose. La pianta è a croce latina, con navate lunghe 153 metri e larghe 38 metri. Il transetto è lungo 90 metri e la cupola ha un diametro di 45,5 metri, lo stesso dell'intero Battistero: un'ampiezza insolita nel gotico e che creerà non pochi problemi tecnici al momento di chiudere il tutto con una volta. Solo Brunelleschi vincerà la sfida di Arnolfo.
Il pavimento è in marmo policromo e il suo disegno è attribuito a Baccio d'Agnolo e Francesco da Sangallo (1520-26). Il restauro successivo all'alluvione del 1966 ha rivelato che nella sua costruzione sono stati impiegati, rovesciati, pezzi di marmo provenienti dalla facciata di Arnolfo.

Le navate e la tribuna prendono luce da belle vetrate quattrocentesche dovute ad artisti come Ghiberti, Paolo Uccello, Donatello e Andrea del Castagno. Da osservare in particolare la controfacciata interna, la parte più antica della chiesa. Sulla lunetta sopraporta è infatti visibile un mosaico di Gaddo Gaddi (primi secolo XIV), attivo anche nei mosaici del Battistero. Le tre vetrate rotonde sono eseguite su cartoni del Ghiberti (1403-13), come quelle della cupola, e costituiscono una delle pochissime prove rimasteci della sua attività pittorica.

Celebre, sulla controfacciata, anche l'orologio, con quadrante e medaglioni dipinti a fresco da Paolo Uccello (1443). È uno dei pochi orologi meccanici esistenti e ancora in funzione: ha una sola lancetta e conta le ore in senso inverso rispetto ai moderni in quanto misura il tempo da un tramonto all'altro. Sulla parete anche la tomba del Vescovo d'Orso (1321), fra le più belle sculture del Duomo.

Lungo la navata sinistra gli affreschi di Paolo Uccello e Andrea del Castagno e sulla cupola il Giudizio Universale di Vasari-Zuccari. Storica, anche se non di eccelsa qualità, la tavola di Domenico di Michelino (1465) che rappresenta Dante, Firenze e la sua "Commedia". È il solo omaggio reso in antico dalla città al sommo poeta. Il crocifisso in legno sovrastante l'altar maggiore è opera dello scultore Benedetto da Maiano (1477).

Lungo il transetto si aprono le tre absidi, separate dalle due sacrestie (bassorilievi di Luca della Robbia) e ognuna ripartita in cinque cappelle. Nella cappella dietro l'altar maggiore un capolavoro d'oreficeria del Ghiberti: l'Urna di San Zanobi. Sotto la cupola il vasto coro ottagonale recintato da un'elegante balaustra in marmo di Baccio Bandinelli (1555), i cui numerosi elementi decorativi (bassorilievi e statue) sono oggi conservati nel Museo dell'Opera del Duomo, in Santa Croce e al Bargello.