Nei primi anni del Novecento venne istituito dall'allora direttore della Galleria degli Uffizi Corrado Ricci il Gabinetto dei Disegni e delle Stampe, ricco di circa 110.000 pezzi e dotato di sale per esposizioni, biblioteca, fototeca e iconoteca.

Quella che è oggi una delle maggiori raccolte al mondo di disegni e stampe fu iniziata dal cardinale Leopoldo de' Medici verso la metà del Seicento, il secolo d'oro del collezionismo. Dopo la sua morte (1675), il materiale fu trasportato da Palazzo Pitti agli Uffizi e fu riordinato dall'erudito Filippo Baldinucci su commissione del granduca Cosimo III: ammontava già a 11.810 fogli ordinati in circa 100 volumi.

La raccolta fu poi accresciuta di continuo da lasciti e acquisti, fino a raggiungere oggi la considerevole cifra di oltre 50.000 disegni e 60.000 stampe di tutti i maggiori artisti (solo in piccola parte moderni) italiani e stranieri, fra cui Paolo Uccello, Beato Angelico, Botticelli, Leonardo, Michelangelo, Raffaello, Bruegel, Durer, Rubens, Lorrain e molti altri.

I locali del Gabinetto, cui si accede dal magnifico scalone Vasariano, si trovano al primo piano del Palazzo, dov'era anticamente il Teatro Mediceo, costruito dal Buontalenti nel 1585 per le grandi feste di corte, i balli e le rappresentazioni teatrali. Questo grande teatro, uno dei primi dell'età moderna, che vide tra l'altro la nascita del melodramma agli inizi del Seicento, occupava gran parte di quest'ala dell'edificio e fu demolito nel 1889.

La prima saletta del Gabinetto è dedicata a mostre temporanee.