Contiene opere del pieno Manierismo, forma d'arte rivoluzionaria e difficile emersa a Firenze come conseguenza dell'esperienza michelangiolesca. Ne sono grandi interpreti due discepoli di Andrea del Sarto: Rosso Fiorentino e Pontormo (influenzato anche dal tedesco Dürer). Ma la seconda metà del Cinquecento vede anche emergere la pittura di corte, levigata e colta, del Bronzino (peraltro allievo del Pontormo), presente con molti ritratti anche nella Tribuna della Galleria.

Rosso FiorentinoMadonna in trono con Bambino e Santi

Jacopo PontormoCena in Emmaus

PontormoMadonna col Bambino, Santi e due Angeli

PontormoRitratto di musicista

BronzinoRitratto di gentildonna (Vittoria Colonna?) con cammeo

BronzinoSacra Famiglia Panciatichi

BeccafumiSacra Famiglia con San Giovannino

FranciabigioRitratto di giovane con guanti