In quattro secoli di vita la Galleria degli Uffizi ha subìto varie modifiche. Alla prima sistemazione come museo appartengono la Tribuna del Buontalenti (1584), oggi Sala 18, e alcuni ambienti adiacenti: la saletta degli strumenti scientifici (oggi Sala 17), la Terrazza delle carte geografiche (oggi Sala 16) e cinque salette volute da Ferdinando I, fratello e successore di Francesco I, per la raccolta delle armi (oggi Sale 19-23). Al termine di questo primo corridoio, posto a levante, era il Gabinetto di Madama (oggi Gabinetto delle miniature) dove la granduchessa teneva le sue gioie e si conservavano "idoli" (bronzetti antichi) e miniature. Pur ospitando ormai in prevalenza dipinti, questi ambienti conservano ancora il loro suggestivo tono cinquecentesco.
Nel Seicento, Ferdinando II fa completare le volte del secondo e terzo corridoio, dedicando i loro affreschi alle glorie fiorentine, e Cosimo III usa questi spazi per esporvi i nuovi "gioielli" delle collezioni granducali. Si creano così, sul lungo corridoio di ponente, il Vestibolo (attuale uscita sulla scala del Buontalenti) con pezzi archeologici e iscrizioni antiche, la Stanza delle Porcellane (oggi Sala 34, del Veronese), la Sala del Medagliere (oggi Sala 41, di Rubens), che conteneva ben 30.000 pezzi, e la Stanza degli Autoritratti (oggi Sala 35, del Tintoretto), quest'ultima raccolta sarà poi spostata nel Corridoio Vasariano.

In Galleria si ammassano anche, in attesa di sistemazione, i disegni del cardinale Leopoldo, nucleo centrale del Gabinetto Disegni e Stampe, le miniature e gli oggetti in pietra dura. Cresce anche la raccolta delle sculture antiche, con l'acquisizione di pezzi eccezionali come l'Ermafrodito, l'Amore e Psiche, i Lottatori e la Venere medicea. Già nel 1689 i corridoi esibivano circa 102 busti e 72 statue. Il loro primo restauratore ufficiale, lo scultore Ferrata, fu alloggiato in Palazzo Vecchio per essere più vicino alle opere da curare.
In epoca lorenese (1737-1860) la Galleria degli Uffizi non perde certo di importanza e gli acquisti di opere d'arte continuano anche se si lamentano alcuni errori come la liquidazione dell'Armeria Medicea (1775) o la riduzione della collezione di maioliche.

Ma le maggiori novità sono di carattere amministrativo. Il "Custode" Giovanni Bianchi stampa la prima guida del museo (1759), si allestiscono la Sala della Niobe (corridoio ovest, architetto Gaspare Maria Paoletti) e il Gabinetto delle gemme, oggi Sala 24, delle miniature (1782, architetto Zanobi del Rosso), si nomina un direttore (1765, è Giuseppe Bencivenni Pelli assistito da Luigi Lanzi), si incaricano le Guardie Reali di sorvegliare i dipinti (1793), si mettono i cartellini alle opere per agevolare i visitatori (1795).
Sotto l'impulso dell'Illuminismo, il granduca Pietro Leopoldo di Lorena comincia (1780-82) il riordino delle collezioni in senso scientifico-didattico e trasferisce alcune attività dagli Uffizi ad altre sedi come l'Accademia. È il caso dell' Opificio delle pietre dure

Fra Sette e Ottocento intere collezioni vengono trasferite per costituire nuovi musei: La Specola (con gli strumenti scientifici), il Museo Egizio (1852), il Museo Etrusco (1870) e il Bargello (1865), dedicato alle sculture del Quattro-Cinquecento. Una sezione di dipinti viene distaccata alla Galleria d'arte moderna di Pitti, i quadri dell' Angelico vanno a San Marco, un'intera quadreria parte per Lucca.

Le ristrutturazioni dell'ultimo secolo vedono la realizzazione della Sala dei Primitivi ad opera degli architetti Scarpa, Michelucci e Gardella (1953-56), il restauro della chiesa di San Pier Scheraggio inglobata dal Vasari nel Palazzo (1971, architetto Bemporad), la sistemazione delle sale del Lippi (1973-'74, Sala 8), del Botticelli (1978, Sala 10-14) e di Leonardo (1979, Sala 15).

Attualmente sono circa 1.700 i dipinti esposti, mentre altri 1.000 sono ordinati (e visibili su richiesta) nei nuovi Depositi creati nel 1978. In corso di realizzazione il progetto "Grandi Uffizi", delineato fin dal 1964, che prevede un nuovo ingresso da piazza Castellani e un notevole ampliamento di spazi, sia per l'esposizione che per le attrezzature e i servizi. Alle storiche 45 sale del secondo piano si aggiungeranno così quelle del primo piano, fino a pochi anni fa occupate dall'Archivio di Stato.